Er is onderzoek gedaan naar de bepaling van de rhesusfactoren. De rhesusfactor wordt bepaald doormiddel van het Desoxyribonucle??nezuur (DNA). Om dit te bepalen worden er een aantal technieken toegepast.
Rhesusfactoren zijn antigenen die zich bevinden op de rode bloedcellen. Bij de rhesusfactoren zijn er verschillende soorten antigenen en deze worden ook wel irregulaire stoffen genoemd. Dit wordt weergegeven in letters, zoals D, c, C, E en e. De rhesusfactor is belangrijk om te bepalen en dit geldt vooral bij zwangere vrouwen en bij bloed transfusies. Bij de zwangerschap is het antigen D erbij betrokken. Wanneer het antigen D aanwezig is in het bloed is het positief en wanneer het antigen D niet aanwezig is in het bloed is het negatief. Wanneer bij de vrouwen het antigen D niet aanwezig is kan dit gevolgen hebben voor het kind, wanneer het kind wel deze antigen bevat. De vrouw gaat dan antistoffen maken tegen het kind en kan daardoor grote gevolgen hebben voor het kind [1].
Ook bij bloed transfusie zijn de hoofdbloedgroepen in beeld, dit zijn A, B, AB en 0. Deze hoofd bloedgroepen worden weer gegeven met negatief of positief. Dit heeft te maken met de rhesusfactor D en dat deze aanwezig is of niet. Wanneer deze wel aanwezig is, dan is het positief. Is deze niet aanwezig, dan is het negatief. Ook bij bloedtransfusie is het belangrijk dat het juiste bloed wordt gegeven. Als er positief bloed wordt gegeven aan een persoon met negatief bloed, dan ontstaat er agglutinatie in het bloed en dit kan ernstige gevolgen hebben [2].
Het is belangrijk dat er van te voren onderzoek wordt gedaan naar deze rhesusfactoren. De rhesusfactoren kunnen worden onderscheiden in 2 soorten, het fenotype en het genotype. Het fenotype wordt bepaald via het bloed en het genotype via het DNA.
Om de rhesusfactoren te bepalen worden er een aantal technieken toegepast. De technieken die daarvoor worden gebruikt zijn DNA-isolatie, polymerase chain reactie (PCR) en gel elektroforese.
De eerste techniek die wordt uitgevoerd is DNA-isolatie. Dit gebeurd door DNA uit de wangslijmvliescellen te halen. De eerste stap bij DNA-isolatie is het openbreken van de cellen. Dit kan worden gedaan door de cellen bloot te stellen aan een hogere druk of door de osmotische waarde te veranderen, waardoor de cellen openbarsten. Dan worden de celresten verwijderd, dit wordt gedaan door het DNA te centrifugeren. Na de centrifuge worden de celresten verwijderd. Dan moeten de eiwitten worden verwijderd. Dit wordt gedaan door er een stof bij toe te voegen dat ervoor zorgt dat er een scheiding ontstaat tussen het DNA en de eiwitten. De laatste stap is om het ribonucle??nezuur (Rna) te verwijderen. Om het Rna te verwijderen wordt er Rnase toegevoegd. Dit is een enzym dat er voor zorgt dat het Rna wordt afgebroken. Vervolgens wordt dit gecentrifugeerd en is er een scheiding ontstaan tussen het DNA en het Rna. Dan kan het DNA uit het cupje worden gehaald en is er ge??soleerde DNA [3].
De volgende stap is PCR. Het principe van PCR is het verdubbelen van het DNA. Om dit uit te kunnen voeren zijn er losse nucleotiden, primers en thermus aquaticus polymerase ( taq polymerase) nodig om het DNA te verdubbelen. Ook wordt er gebruik gemaakt van verschillen temperaturen. De PCR doet 3 stappen, voordat het DNA is verdubbeld. De eerste stap is de denaturatie stap. De temperatuur wordt gebracht op 90 ‘ 95 graden, hierdoor wordt het DNA gesplist, doordat de binding van waterstofbruggen worden verbroken. Vervolgens komt de stap annealing (aanhechting). De temperatuur wordt hierbij iets verlaagd. De temperatuur zit dan tussen de 50 en 60 graden. In deze stap kunnen de primers binden aan de gescheiden ketens. De laatste stap is elongation ( verlenging). Bij deze stap wordt het DNA verlengt, dit wordt gedaan door het Taq polymerase. Die zorgt ervoor dat de losse nucleotiden worden gekoppeld aan de streng van het DNA en dit zorgt voor de verlenging. Wanneer de elongation klaar is, is het DNA verdubbeld. Deze 3 stappen zijn samen ‘?n cyclus. Totaal worden er ongeveer 40 cycli uitgevoerd, daarna is er genoeg DNA om mee verder werken. De PCR kan enkele uren duren [4].
De laatste techniek is de gel elektroforese. Bij deze stap wordt het DNA zichtbaar. Het DNA wordt op grote gescheiden en wordt vervolgens onder het UV-licht bekeken, hiermee worden de rhesusfactoren bekend. Eerst wordt er een agarosegel gemaakt, deze gel bevat buffer met agarose en ethidium bromide. In het gel bevinden zich gaatjes en in die gaatjes wordt het DNA in gepipetteerd met verschillende antiserums. Om het DNA goed te kunnen zien wordt er een loading dye aan toegevoegd, dit zorgt ervoor dat het DNA blauw kleurt. Het gel komt in de elektroforese en deze wordt onder stroom gezet. Het DNA is negatief geladen en wordt dus aangetrokken aan de + pool. Ook wordt er ethidium bromide toegevoegd, dit zorgt ervoor dat het DNA zichtbaar is onder het UV-licht. Ethidium bromide is positief geladen en wordt dus aan getrokken door de ‘ pool, hierdoor gaat het door het DNA heen. Wanneer de elektroforese is afgelopen, kan het DNA worden bekeken onder het UV-licht en zijn de resultaten van de rhesusfactoren bekend [5].
De doelstelling voor dit onderzoek was: Het bepalen van de rhesusfactoren van het DNA van het genotype en dat deze overeenkomen met het fenotype. De rhesusfactoren van het fenotype zijn van te voren bepaald.
2. Materialen en methoden
Voor het bepalen van de rhesusfactoren zijn er een aantal technieken toegepast. Hierbij is gebruik gemaakt van DNA-isolatie, PCR en DNA gel elektroforese.
2.1 DNA isolatie
Het principe van DNA-isolatie is het openbreken van de cellen en er voor zorgen dat alle stoffen uit deze cellen worden verwijderd en dat er alleen DNA overblijft. Het DNA dat overblijft kan worden gebruikt voor verdere onderzoek en ook om de rhesusfactoren te bepalen. De DNA-isolatie was als volgt uitgevoerd [3].
Om DNA te verkrijgen moest er eerst gekauwd worden op de wangen, zodat er speeksel vrijkomt. Het speeksel bevat DNA. Onder het kauwen moest het worden gespoeld met 2 milliliter (ml) fysiologisch zout en dit werd vervolgens uitgespuugd in een maatbeker. Daarvan werd er 1 ml celsuspensie over gepipetteerd in een cupje en deze werd in de centrifuge gezet op 90 seconden en op maximale snelheid ( 13.3 x 10000 revolutions per minute (rpm), 17 gravitatieconstante (g).) Nadat het gecentrifugeerd was, werd het supernatant verwijderd uit het cupje door het eruit te pipetteren. Als volgt is er 100 microliter instagene matrix in een cupje gepipetteerd en daarbij werd er 30 microliter celsuspensie bij gepipetteerd. Het cupje werd in het PCR apparaat gezet voor 10 minuten op 99 graden, nadat het PCR programma klaar was, werd het cupje in de centrifuge gezet op 90 seconden en op maximale snelheid ( 13.3 x 10000 rpm, 17 g.) Nadat het centrifugeren klaar was werd daarvan 30 microliter supernatant over gepipetteerd in een cupje. Het DNA was nu zover dat het gemeten kon worden. Dit werd gemeten met de Nanodrop. Om de nanodrop te gebruiken moest er eerst een blanco worden gemaakt, deze was aanwezig. Op de nanodrop werd eerst een druppel milli-Q (MQ) water gedaan en dit werd gemeten. Vervolgens werd dit ook met een druppel van de blanco gedaan. Daarna kon het DNA worden gemeten door 1 microliter ge??soleerde DNA te pipetteren op de nanodrop. Hieruit kwamen de resultaten van de zuiverheid van het DNA. Door de zuiverheid van het DNA te meten, kon er worden gekeken of er met het DNA verder kon worden gewerkt.
2.2 PCR
Bij de PCR wordt het DNA verdubbeld. Dit wordt gedaan met een PCR apparaat. Wanneer het DNA is verdubbeld noemt men dat een cyclus. Het PCR programma duurt een aantal cyclussen en dit duurt een aantal uren. Wanneer deze cyclussen klaar zijn, is er genoeg DNA voor verdere onderzoek. De PCR was als volgt uitgevoerd [4].
Er werd 110 microliter mastermix in een cupje gepipetteerd. De inhoud van het mastermix is te vinden in bijlage 1, tabel 4. Daarna werd er 20 microliter DNA aan het mastermix toegevoegd die verkregen is bij de DNA-isolatie. Vervolgens werden er PCR cupjes gevuld met de juiste eenheden. De inhoud per cupje is te zien in tabel 1. De inhoud van de primermix en de DNA sequenties zijn te vinden in bijlage 1, tabel 5 t/m 10.
Tabel 1: inhoud cupjes [6]
De cupjes werden vervolgens in het PCR apparaat gezet en werd het PCR programma gestart. Het PCR programma bestond uit 35 cycli en duurde enkele uren. Het PCR programma is te zien in tabel 2.
Tabel 2: PCR programma [6]
2.3 DNA gelelektroforese
Met de DNA gel elektroforese wordt uiteindelijk de rhesusfactoren bekend. Er wordt een gel gemaakt en in die gel wordt het DNA in gepipetteerd. Doormiddel van elektroforese gaan de DNA fragmenten door het gel heen van de + pool naar de – pool. Door ethidium bromide toe te voegen worden deze DNA fragmenten zichtbaar onder UV-licht, hierdoor kan de rhesusfactoren bepalen. De DNA gel elektroforese was als volgt uitgevoerd [5].
De gel elektroforese bakje, waarin het gel werd gemaakt, werd eerst afgeplakt met schildertape. Dit zorgde ervoor dat het gel er niet uitgleed. Vervolgens was er een 10x TBE-buffer gemaakt door 100 milliliter TBE-buffer aan 900 milliliter demiwater toe te voegen in een maatcilinder. De oplossing werd vervolgens op de magneet roerder gezet om het goed te mengen. Ondertussen werd er 1 gram ultrapure invitroge agarose afgewogen en is in een erlenmeyer gedaan, daarbij werd 50 ml van de 10x TBE-buffer oplossing aan toegevoegd. De erlenmeyer met de ultrapure invitroge agarose en de 50 ml 10x TBE-buffer werd in de magnetron gezet tot het op zijn kookpunt kwam, vervolgens is het mengsel gezwenkt en weer in de magnetron gezet tot het weer op zijn kookpunt zat. Het mengsel is vanuit de magnetron in de zuurkast gezet en daar werd er 5 microliter ethidium bromide aan toegevoegd, vervolgens is het mengsel gezwenkt en in de gele lektroforese bakje gegoten. Wanneer het gel aan het stollen was, dit duurde z’n 30 minuten, werd de marker gemaakt. De marker bevatte 8 microliter millipore water, 2 microliter loading dye en 2 microliter Low MW DNA marker. Het PCR programma was intussen ook afgelopen. De cupjes werden uit het PCR apparaat gehaald en daarbij werd er aan elk cupje 5 microliter loading dye aan toegevoegd. Inmiddels was het gel ook gestold. Het gel is uit de zuurkast gehaald en uit het gel werd het kammetje gehaald, hierdoor ontstond er slotjes waarin het DNA in gepipetteerd kon worden. De schilderstape werd om de gel elektroforese bakje weggehaald. Dit was niet meer nodig, omdat het gel gestold was. Het gel is vervolgens in de elektroforese gezet en de elektroforese is gevuld met de 10x TBE-buffer. Vervolgens werden de slotjes gevuld.
– Eerste slotje bevatte 10 microliter marker.
– Tweede slotje bevatte 24 microliter monster D.
– Derde slotje bevatte 24 microliter monster grote C.
– Vierde slotje bevatte 24 microliter monster kleine c.
– Vijfde slotje bevatte 24 microliter monster grote E.
– Zesde slotje bevatte 24 microliter monster kleine e.
– Laatste slotje bevatte 24 microliter negatieve controle 1.
(voor de inhoud van de negatieve controle 1 zie bijlage 2, tabel 11).
Aan de + pool werd 7 microliter ethidium bromide toegevoegd in de 10x TBE-buffer. Vervolgens werd de deksel er opgezet en werd het programma gestart. Het programma duurde ongeveer 45 minuten en op 120 volt (V). Wanneer het programma afgelopen was, werd het gel uit de gel elektroforese gehaald en meegnomen naar de gel analyzer. Het gel werd in de gel analyzer geplaatst en door het UV-licht werden de resultaten zichtbaar van de rhesusfactoren.
3. Resultaten
3.1 DNA-isolatie
De resultaten van het ge??soleerde DNA is verkregen doormiddel van het DNA dat overbleef, nadat het DNA ge??soleerd was. Dit werd vervolgens gemeten met de nanodrop. De resultaten van de DNA isolatie zijn te zien in figuur 1.
Figuur 1: resultaat DNA isolatie
In figuur 1 is af te lezen dat bij een golflengte van 260/280 het DNA een zuiverheid heeft van 1,2. Het DNA moet eigenlijk een zuiverheid hebben van 1,8 bij een golflengte van 260/280 om met het DNA verder te werken. Verder is er te zien dat het DNA 57,9 nanogram per microliter bevat.
3.2 Gelelektroforese
Vervolgens de resultaten van de gel elektroforese. Deze resultaten zijn verkregen door het DNA eerst te vermeerderen met het PCR apparaat. Daarna is er aan het DNA antiserums toegevoegd en zijn vervolgens in de slotjes gepipetteerd van het gel van de gel elektroforese. De gel elektroforese werd onder stroom gezet en na ongeveer 45 minuten was dit klaar en kon de resultaten worden bekeken onder het UV-licht. De resultaten zijn te zien in figuur 2.
Figuur 2: Resultaat gelektroforese
In figuur 2 zijn de resultaten zichtbaar van de rhesusfactoren genotype. In het eerste bandje zit de marker. De marker bevat DNA fragmenten van bekende grote. Deze zijn weergegeven in basenparen (bp). De 200 bp bevat het meeste DNA en daarmee worden de resultaten van de antigenen mee vergeleken. De bandjes die zichtbaar zijn bij 150 bp zijn antigen D, antigen C en antigen e. Dit zijn de PCR producten rhesusfactor, dit betekend dat bij deze persoon het genotype CDe is. Er is ook een licht bandje te zien bij antigen E bij 150 bp, maar dit bandje is te licht en wordt als negatief gezien. Ook zijn er bandjes te zien bij 434 bp, dit is de positieve controle. Wanneer het allel aanwezig is, is hier een licht bandje te zien, dit geeft aan dat de PCR gelukt is. Ook is er een bandje te zien bij de positieve controle, wanneer het allel niet aanwezig is. Deze is dan duidelijk zichtbaar. In het laatste slotje zit de negatieve controle. De negatieve controle bevat geen DNA en als dit wel zo is, zijn er ook bandjes te zien bij de negatieve controle. Dit is om te kijken of het behaalde resultaat van de proefpersoon zelf is. Bij deze proef zijn er geen bandjes zichtbaar bij negatieve controle en zijn de resultaten correct.
De resultaten van de rhesusfactoren van het genotype wordt vergeleken met die van het fenotype. De resultaten van het fenotype zijn te zien in tabel 3. Deze waren van te voren bepaald.
Tabel 3: resultaten fenotype
In tabel 3 zijn de resultaten van het fenotype te zien, hieruit is af te leiden dat de rhesusfactor voor het fenotype cCDee is. Volgens de literatuur is de meest waarschijnlijk genotype die daarbij hoort CDe of cde [7]. Dit betekend dat de resultaten van het genotype van deze proefpersoon overeenkomen met het fenotype.
4. Conclusie / discussie
De doelstelling voor deze proef was het bepalen van de rhesusfactoren van het DNA van het genotype en dat deze overeenkomen met het fenotype. De resultaten zijn volgens verwachting, want het genotype komt overeen met het fenotype. De rhesusfactoren van het fenotype is cCDee, de meest waarschijnlijke genotype die daarbij hoort is CDe of cde. Dit fenotype komt volgens de literatuur 34,5 % voor in West-Europa. Uit de resultaten is uitgekomen dat deze proefpersoon rhesusfactoren voor het genotype CDe zijn. Dit genotype komt volgens de literatuur 32,8 % voor in West-Europa [7]. Deze fenotype en genotype zijn de meest voorkomende rhesusfactoren in West-Europa.
Wat tegen de verwachting was, was het resultaat van de DNA-isolatie. het resultaat van de zuiverheid van het DNA was 1,2 en het had 1,8 of hoger moeten zijn. dit heeft te maken met dat er gebruik is gemaakt van instagene matrix, dit zorgt ervoor dat de zuiverheid van het DNA minder wordt. Het DNA kon nog steeds worden gebruikt voor verdere onderzoek. Een optie zou zijn om een alternatief voor instagene matrix gebruiken bij het nog een keer uitvoeren van deze proef, waardoor de zuiverheid van het DNA wel juist is.
Het resultaat van de gelelektroforese was wel volgens verwachting, alleen is er op het gel overloop van DNA te zien (zie figuur 2). Dit kan komen doordat het DNA niet goed in de slotjes is gepipetteerd, waardoor er overloop ontstaan is van het DNA tussen de basenparen. Ook is er te zien dat bij antigen kleine c helemaal geen bandjes zichtbaar zijn. Wanneer deze niet aanwezig is, zou er een bandje zichtbaar moeten zijn bij 434 bp bij de positieve controle en in dit geval is dat niet zo. Dit geeft aan dat de PCR waarschijnlijk mislukt is. Dit kan verschillende oorzaken hebben, zoals dat er geen DNA aanwezig was, verhoudingen niet kloppen of dat er onjuist is gepipetteerd. Door dit soort oorzaken zou de PCR mislukt kunnen zijn bij antigen kleine c.